根據《醫療機構新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊(試行第二版)》通知,“人群篩查應選擇具有病毒滅活功能,如含胍鹽(異硫氰酸胍或鹽酸胍等)或表面活性劑的采樣管。”
滅活型病毒采樣管可高效滅活病毒,保護病毒核酸不被降解,且能在常溫下保存較長時間,為樣品保存及運輸節省成本。選擇滅活效果好的病毒采樣管,有助于確保后續核酸檢測質量。
病毒采樣管滅活效果試驗方法
參考《消毒技術規范》(2002版)病毒滅活試驗中描述的檢測方法,確定病毒保存管滅活能力。
步驟一:細胞培養
將生長狀態良好的HEK293T細胞消化計數后稀釋至1×104/mL,按照100μL/孔的體積,每個梯度的病毒做三個復孔,計算所需接種孔數,將細胞緩慢均勻接種至96孔板中。放入37℃,5%CO2培養箱中培養過夜。
步驟二:慢病毒稀釋
將病毒滴度為107-108TU/mL的慢病毒按10倍梯度進行稀釋,連續稀釋3個梯度。
步驟三:病毒滅活
把稀釋好的病毒置于室溫條件下,與滅活款病毒保存液(批號:220201/220207/220211)按1:1體積比進行混合,置于室溫下分別放置1min、5min和10 min進行滅活。
步驟四:終止滅活
采用病毒分離培養基(可用DMEM完全培養基替代)進行1000倍稀釋以中和滅活保存液,終止滅活。
陰性對照:為病毒分離培養基對滅活款病毒保存液稀釋1000倍的混合液;
陽性對照:為病毒分離培養基對病毒原液稀釋1000倍的混合液。
步驟五:病毒孵育
將事先培養的HEK293T細胞中吸棄細胞培養基,每孔加入100μL準備好的病毒混合液,和對應的陽性對照、陰性對照。病毒孵育3小時,每隔30分鐘從培養箱中取出晃動一次。
步驟六:細胞培養
孵育結束后,將病毒液吸去,每孔中加入100μL DMEM完全培養基,將96孔板置于37℃,5% CO2培養箱中培養,并觀察細胞狀態。
步驟七:熒光細胞觀察與計數
繼續培養48-72h,期間觀察細胞狀態,若細胞培養液變黃,應換液,對熒光細胞個數適量的孔進行計數,計算病毒滴度。
中科檢測提供病毒采樣管檢測服務,包括病毒采樣管滅活效果試驗,為企業與原料廠商提供技術支撐,為社會防疫物資供應提供保障。